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中華國際癌病康復協會期刊 漢方與生活

內容
中草藥複方抑癌與誘發癌細胞凋亡研究(青杏3號)
中草藥複方抑制多種人類癌細胞生長與誘發癌細胞凋亡之研究
 
一、 前言
       
      (一)  研究背景
       
        細胞凋亡(apoptosis)是生物體中一種主動性的死亡方式,使生物體在發育過程中可控制細胞數目及組織大小以維持生物體的恆定。並且可藉由清除受損或突變異常的細胞,防止疾病的產生,因此誘發癌細胞凋亡為治療癌症的先決條件。
        人體由上萬億個細胞組成,據科學家估計,數目約為10的15次方,而每天身體中有十億個以上細胞凋亡並由新生細胞所取代,在這個情形下,細胞的生成和凋亡必須要能精確地平衡。如果細胞凋亡數目過多,器官將退化,引起如阿滋海默氏症這樣的病變;反之則細胞的生成將失去控管,發展成為癌症。也就是說癌細胞,是在不受控制下,一路進行分裂和擴張,終至產生腫瘤。
        細胞凋亡或稱為細胞程式死亡,此現象是在1965年由John Kerr首先觀察到,並在1972年將之命名為細胞凋亡。細胞凋亡是一種正常生理性細胞死亡,過程中由特定的蛋白質及酵素調控循序漸進使細胞死亡。正常細胞都擁有感應系統來偵測細胞內外傳來的訊息,當偵測到不利其正常生長的訊息時,就引發程式死亡。也就是說人體其實有一個抗癌的機制:如果有一些細胞受到損害,例如受到放射性或化學藥物的影響,使基因受到破壞,這個細胞的立即反應是馬上著手修復這個受破壞的基因,設法回復成為一個正常細胞。若是修復無效,就隨即啟動細胞凋亡的機制。但如果細胞凋亡機制出了問題,應該死的細胞繼續生存,則一個含有基因突變的細胞,在不受人體的控制之下,不斷增殖,慢慢就會釀成一個腫瘤。
        20多年來癌症為國人十大死亡原因的第一位,因此生醫界對於癌症的研究不曾停止,近年來生物醫藥界對於癌症藥物的研究開發焦點之一便是誘導癌細胞凋亡。由於細胞凋亡過程溫和,一切都在既定的程式下進行,最後由特定酵素將DNA切成片段,造成細胞死亡。在這凋亡的過程中,細胞外形皺縮但細胞膜維持完整,以防止細胞內成份外流,避免在體內引起發炎反應。因此一般抗癌藥物的研究上,希望能藉由造成癌細胞凋亡以達到治療的目的。
      中草藥複方是從中藥所提煉出來的,具有抗癌、抗發炎和免疫調節的作用,其主要成分包含冬蟲夏草、白花蛇舌草、青黛、豬苓、黃蓍、人參、龍葵、藿香、白朮、天花粉、威靈仙、珍珠、女貞子、甘草、冰片等,其亦為抗癌用漢藥複方,已為癌症病人廣泛使用,且療效顯著。
 
      (二實驗目的
 
        我們先前的研究顯示中草藥複方可以刺激人體免疫功能,且對於自人體分離出的周邊血液單核球(PBMC)和T細胞具有免疫調節作用,為了更進一步研究中草藥複方抗腫瘤的活性,我們針對包括台灣十大癌症的15種癌細胞研究,探討中草藥複方是否會造成這些癌細胞的凋亡。
 
      (三)  實驗說明
        
        本研究利用15種人類癌細胞株及兩種人類正常細胞株(人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和周邊血液單核球(PBMC))來檢測中草藥複方存在與否對其的影響。中草藥複方對於細胞生長的抑制效果利用活細胞計數來測量;中草藥複方誘發凋亡的實驗,則利用四種分析方法檢測:
  1. 利用Hoechst 33342螢光染色觀察細胞形態;
  2. 利用TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)作免疫染色,TUNEL是一種用來檢測細胞凋亡(apoptosis)的分析方法;
  3. 利用DNA降解的分析,細胞凋亡中最重要的生化改變是細胞核內DNA的斷裂,形成間隔180~200bp整數倍的階梯狀電泳條帶(DNA ladder)。利用這一特性,將凋亡細胞核萃取物進行瓊脂糖凝膠電泳,即可得到上述典型的改變;
  4. sub-G1細胞的分析,在細胞週期中,G1時期就是細胞開始休息,到S 時期,DNA開始準備合成,G2則準備分裂,其中將細胞週期停留在Sub-G1時期,則細胞不會繼續分裂,而沒法增殖,終至凋亡。
        此外,本實驗還檢測中草藥複方存在與否對於Caspase 8、9和3的活性影響,找出中草藥複方誘發細胞凋亡的可能機制。
      
二、 結果

        為了解中草藥複方在體外細胞培養的狀況下對細胞產生的影響,我們首先選用一株肺癌細胞,NCI-H1299,在37℃,5% CO2的培養狀況下加入不同濃度的中草藥複方培養20小時。在相位差顯微鏡下觀察細胞型態時,可以發現:如下圖所示經過1%中草藥複方處理的癌細胞,其型態變成圓化與皺縮,細胞膜不平整,及部分細胞漂浮至培養液中,這是典型的細胞凋亡現象。

          

         進行TUNEL染色後,用螢光顯微鏡觀察細胞凋亡的情形。綠色的部分表示正在進行細胞凋亡的細胞核,細胞凋亡時,其DNA會被切成小片段,TUNEL染色分析法,即是用螢光標定這些斷裂的DNA,因此正在進行凋亡的細胞,其細胞核會被染成綠色,而正常細胞則否。

        紅色的部分是以propidium iodide ( PI ) 進行細胞核染色後產生的螢光,無論細胞是否進行細胞凋亡,細胞核都會被染成紅色,目的是顯示細胞核的位置,確認前述的綠色螢光確實是位於細胞核內。
        我們可清楚看到,當加入1%中草藥複方時,細胞凋亡的現象非常明顯,如下圖C所示,右邊的細胞經過中草藥複方處理後,都可以發出綠色的螢光,顯示中草藥複方的確能造成癌細胞的凋亡。

     
   
 
 
        當濃度遞減至0.5%及0.2%時,則細胞凋亡的比例明顯降低。為了清楚地判定細胞凋亡的現象,本研究接下來的研究都以1%的中草藥複方進行實驗。
        除了研究中草藥複方造成癌細胞的凋亡之外,我們也測試中草藥複方對癌細胞生長的影響。中草藥複方包含極多的微細懸浮顆粒,為了研究中草藥複方抑制癌細胞的活性是來自這些懸浮顆粒或液體本身,我們將中草藥複方的懸浮顆粒用高速離心法去除,然後測試中草藥複方原液 (含懸浮顆粒) 及中草藥複方上清液 (不含懸浮顆粒) 對癌細胞生長的影響。
        未加入中草藥複方的U-937淋巴癌細胞在30小時內細胞數已生長至原來的兩倍,而加入1%中草藥複方原液或是中草藥複方上清液的細胞,其數目並無增加,甚至有減少的趨勢。這表示中草藥複方原液及上清液會抑制腫瘤細胞的生長。這個結果也顯示中草藥複方抑制癌細胞的活性,不是來自懸浮顆粒而是來自溶液本身。
        由於中草藥複方中的懸浮物質經TUNEL染色後,在紫外光激發下會產生螢光,干擾觀察,因此以下細胞凋亡的實驗都是以中草藥複方上清液來進行。
        我們初期的研究已經發現中草藥複方會造成淋巴癌細胞U-937及血癌細胞K-562的凋亡,在本實驗中,我們進一步探討中草藥複方是否會誘發不同種類的癌細胞的凋亡。這些癌細胞包括列於台灣地區癌症十大死因的肝癌、肺癌、胃癌、子宮頸癌、乳癌等 。
        所有的細胞株皆以1%中草藥複方上清液處理20小時,再經過TUNEL染色,以螢光顯微鏡觀察。結果發現經過中草藥複方處理的癌細胞,大部分的細胞核都被染成綠色,表示這些細胞正在進行細胞凋亡,而未經中草藥複方處理的癌細胞則發出極弱的背景綠色螢光,表示這些細胞無細胞凋亡的現象。
        結果顯示中草藥複方會造成BJAB (B細胞淋巴癌細胞)U-2OS (骨癌細胞)BT-474 MDA-MB-453 (乳癌細胞)C-33 AHeLa (子宮頸癌細胞)U-937 (巨噬細胞淋巴癌細胞)Jurkat (T細胞淋巴癌細胞)HuH-7Hep G2 (肝癌細胞)NCI-H1299 (肺癌細胞)NPC-TW04 (鼻咽癌細胞)DU 145 (攝護腺癌細胞)AGS (胃癌細胞) 的凋亡,但不會造成PC-3 (攝護腺癌細胞) 的凋亡(表一)。
 

細胞

TUNEL染色a

BJAB (B細胞淋巴癌細胞)

+

U-2OS (骨癌細胞)

++

BT-474

+

MDA-MB-453 (乳癌細胞)

+

C-33 A

++

HeLa (子宮頸癌細胞)

+

U-937 (巨噬細胞淋巴癌細胞)

+

Jurkat (T細胞淋巴癌細胞)

+

HuH-7

++

Hep G2 (肝癌細胞)

+

NCI-H1299 (肺癌細胞)

++

NPC-TW04 (鼻咽癌細胞)

+

DU 145 (攝護腺癌細胞)

++

AGS (胃癌細胞)

++

PC-3 (攝護腺癌細胞)

+/-

HUVEC

-

PBMC

-

 
表一:中草藥複方誘發各種癌細胞株和正常細胞株凋亡的效果。
         a++, >80%的細胞被TUNEL染色;+, 40~80%的細胞被TUNEL染色;+/-, 15%的細胞被TUNEL染色;-, <0.1%的細胞被TUNEL染色。
         為了進一步確認中草藥複方確實會造成癌細胞的凋亡,我們利用DNA片段分析法,看看中草藥複方處理過的癌細胞,其DNA是否會斷裂成小片段。結果顯示,加入中草藥複方處理的肺癌細胞 (NCI-H1299) (如下圖D)及鼻咽癌細胞 (NPC-TW04),其DNA已被切成小片段,因此在DNA凝膠分析時,可以觀察到DNA階層的現象,而未加入中草藥複方的細胞則看不到此現象。這個結果顯示中草藥複方確實會造成癌細胞的凋亡。
     
 
 
三、 結論
  1. 中草藥複方可有效而廣泛地毒殺腫瘤細胞。
  2. 中草藥複方可有效專一性的誘發人類15種癌細胞凋亡。
  3. 中草藥複方對於正常細胞(如臍帶內皮細胞及周邊血球細胞)生長並無影響。
  4. 中草藥複方因具有對癌細胞選擇性毒殺特性,使其有潛力成為抗癌有效藥物。
  5. 中草藥複方會降低癌細胞中對抗細胞凋亡蛋白質的表現量,並提高誘發細胞凋亡蛋白質的表現量。
  6. 中草藥複方可有效活化細胞中不同的蛋白質裁切酵素,同時啟動癌細胞的兩種主要凋亡程式進而造成癌細胞凋亡。
發佈時間:2007-05-08 02:05:22
資料來源:中日飛達聯合有限公司